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白藜芦醇对炎症所致椎间软骨终板退变中高迁移率蛋白1信号的影响
发布日期:2022-04-23 18:39   来源:未知   阅读:

  经鉴定所提取细胞为大鼠椎间CEP细胞;CCK-8法筛选出以30 μmol/L RES处理椎间CEP细胞时活性最高;经基因芯片分析确定HMGB1-ERK信号为RES的作用靶点。细胞实验和动物实验均显示,RES处理均能明显下调椎间CEP细胞的凋亡率,抑制TNF-α的释放,升高IL-10的含量;并明显下调HMGB1、p-ERK和Bax蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;且pcDNA3.1能部分逆转RES的上述作用,差异均有统计学意义(P0.05)。

  随着我国居民日常生活状态的改变,椎间盘退行性疾病发生率逐年升高,呈现年轻化趋势,严重影响人们生活质量。此类疾病发展过程中,患者的椎间盘组织水分含量下降,胶原蛋白膜通透性随之改变,纤维环胶原受损,细胞排列紊乱,椎间软骨终板(cartilage endplate,CEP)细胞的结构随之改变,甚至形成骨化[1]。因此,深入揭示椎间CEP 细胞退变的分子机制,寻找维系其活性的可靠作用靶点,对于疾病治疗具有重大意义。

  椎间CEP细胞在炎症性应激下进行性退变发生异常凋亡,进而导致椎间盘组织功能障碍,这是腰椎、颈椎等发生病变的始动因素[2]。当患者椎间CEP出现退变后,严重影响椎间盘组织营养物质、

  氧气的传输以及代谢废弃物的清除,如不能及时有效控制其进展,会导致椎间盘内乳酸含量升高,有机氧含量明显下降,刺激椎间盘内TNF-α等促炎介质释放,以及相关基质金属蛋白酶的转录与翻译,诱导更为激烈的炎症性应激,推动椎间CEP细胞大范围凋亡,同时更进一步降低Ⅱ型胶原蛋白等骨架蛋白以及相关代谢因子的合成[3]。因此抑制椎间盘组织中炎症性应激,缓解椎间CEP退变进程,减轻椎间盘组织的病理损伤,为椎间盘退行性疾病的临床治疗提供了新途径。

  高迁移率蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是一种在真核生物的组织和细胞中广泛分布的小分子蛋白。研究显示[4]HMGB1在骨关节炎、类风湿关节炎等多种炎症性疾病中表达升高,参与调控疾病的进展。Shen等[5]研究显示在胶原诱导的小鼠关节炎模型中,HMGB1 通过调控细胞外信号调节激酶(extracellular singal-regulated protein kinase,ERK)的活性,参与软骨细胞的分化与凋亡。但是有关HMGB1-ERK信号在椎间盘病变中作用的报道较少。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种具有生物活性的多酚类天然产物,具有良好的免疫调节及抗炎、抗癌、抗氧化等作用。Fan 等[6]研究发现在痛风性关节炎小鼠模型中, RES 能明显抑制炎症因子释放,缓解软骨细胞损伤。本研究基于HMGB1-ERK信号,探讨RES对椎间盘退行性病变中椎间CEP的作用,以期为疾 病的临床治疗提供更多研究基础。

  3周龄健康雄性SD大鼠1只,体质量80 g;7~8周龄健康雄性SD大鼠50只,体质量80~100 g;购自广州锐格生物科技有限公司,于我院动物房中以标准饲料澳门资料大全正版免费资料自由饮水适应性喂养1周后用于实验。

  组织包埋机、切片机(Leica公司,德国);BX43光学显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜(Olympus公司,日本);台式离心机(上海精宏实验设备有限公司);超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)仪(Promega公司,美国)。

  取3周龄SD大鼠1只,以40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,将大鼠背部向上固定于手术台上,备皮,作纵切口暴露大鼠椎间盘;取椎间软骨组织,PBS清洗3次后剪碎,0.25%胰蛋白酶消化,离心半径12 cm、1 000 r/min离心10 min;弃上清,收集沉淀物,转移至DMEM培养基中,37℃、5%CO2条件下培养,每2天更换培养基,待细胞完全贴壁后进行传代,光镜下观察细胞形态。取对数生长期的第3代椎间CEP细胞用于后续实验。

  将第3代椎间CEP细胞置于DMEM培养基中,37℃、5%CO2条件下培养,待90%细胞完成爬片后,4%多聚甲醛固定,PBS漂洗,分别采用甲苯胺蓝染色、兔抗大鼠Ⅱ型胶原蛋白细胞免疫荧光染色进行鉴定[7]。

  参照文献 [8] 方法进行检测。取椎间CEP细胞并调整至1×104个/孔接种于96孔培养板,37℃、5%CO2条件下培养24 h后,分别以0、10、20、30、40 μmol/L RES预处理24 h;之后加入10 ng/mL IL-1β,继续于37℃、5%CO2条件下培养24、48、72 h,PBS清洗后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37℃避光孵育2 h,酶标仪检测各组在波长450 nm处的吸光度(A)值,筛选最佳RES浓度。

  参照文献 [9] 方法进行检测。取椎间CEP细胞并调整至1×104个/孔接种于96孔培养板,37℃、5%CO2条件下培养24 h后以最佳浓度RES预处理24 h作为实验组,不添加RES继续培养24 h为对照组;之后加入10 ng/mL IL-1β继续于37℃、5%CO2条件下培养24 h。PBS清洗后,TRIzol试剂提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,再体外合成cDNA,纯化,杂交,Affymix基因芯片分析,将数据通过Feature Extraction软件分析;满足P0.05、Fold Change≥2的基因为差异表达基因,并绘制基因火山图和热图。

  同时行qRT-PCR检测进行验证。常规提取样本中的总RNA,琼脂糖凝胶电泳测定完整性,分光光度计检测其浓度和纯度,逆转录合成cDNA,严格按照各试剂盒说明书,上机进行PCR扩增。反应体系:预变性,2 min,95℃;变性,30 s,95℃;退火,35 s,60℃;40个循环。以GAPDH作为参照物,相关基因的相对表达以2−ΔΔCt进行计算。引物序列见表1。

  连续处理14 d后,进行以下观测:① ELISA检测:每只大鼠取静脉血5 mL,使用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中IL-10和TNF-α的含量。② HE染色:断头处死大鼠,剥离其L5、6椎间盘组织,生理盐水清洗3次,多聚甲醛固定,石蜡包埋,50 nm厚切片。取部分切片行HE染色,光镜下观察大鼠椎间盘组织的病理损伤情况[12]。③ TUNEL染色:取部分切片行TUNEL染色,光镜下观察大鼠椎间CEP细胞的凋亡情况,按文献 [15] 方法定量检测大鼠椎间CEP细胞凋亡率。④ Western blot检测:取适量各组大鼠椎间盘组织,参照文献 [11]方法行Western blot检测目的蛋白HMGB1、ERK、p-ERK、Bcl-2和Bax相对表达量。

  采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料若符合正态分布,数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素分析,两两比较采用LSD检验;若不符合正态分布,数据以M(Q1,Q3)表示,组间比较采用秩和检验;检验水准α=0.05。

  光镜下观察示,细胞培养24 h后逐渐开始贴壁,呈梭形生长;7 d后出现细胞间突起,周围出现基质样物质沉淀;第3代细胞生长旺盛,呈鹅卵石状。甲苯胺蓝染色示细胞质被染成紫红色,Ⅱ型胶原蛋白细胞免疫荧光染色呈阳性,提示所培养细胞为大鼠椎间CEP细胞。见图1。

  图 1 大鼠椎间CEP细胞鉴定a. 第3 代细胞形态观察(×400);b. 甲苯胺蓝染色(倒置显微镜×200);c. Ⅱ型胶原蛋白细胞免疫荧光染色(荧光显微镜×200)

  CCK-8法检测示,24 h时各组A值均降至最低,随培养时间延长逐渐增高。各时间点30 μmol/L RES组A值显著高于其余各浓度组,差异有统计学意义(P0.05)。见图2。因此,后续实验以30 μmol/L作为RES处理浓度。

  将基因芯片分析结果绘制火山图显示,与对照组细胞比较,实验组细胞中有40个基因表达上调,52个基因表达下调;将表达差异较为明显的基因绘制成热图,显示HMGB1、ERK基因表达差异较其他基因更明显。采用qRT-PCR进行验证显示,实验组HMGB1、ERK、Bax、TNF-α的mRNA相对表达量较对照组明显降低,IL-10、Bcl-2的mRNA相对表达量较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。见图3。因此推测RES对大鼠椎间CEP细胞的作用靶点为HMGB1-ERK信号。

  图 3 RES对大鼠椎间CEP细胞的作用靶点检测a. 差异表达基因的火山图;b:差异表达基因的热图;c. qRT-PCR检测

  2.4.1 细胞形态观察光镜观察示,A组椎间CEP细胞的细胞核呈圆形,较大,在细胞质中性状稳定,细胞贴壁生长较快,形状规则;B组细胞染色质出现明显聚集,细胞生长缓慢,出现较多漂浮细胞;C组培养基中出现的漂浮细胞数量明显多于B组,细胞核固缩更严重,细胞形状不规则;D组贴壁生长的细胞数量较B组明显增多,细胞核性状趋于正常,几乎不见漂浮细胞;E组贴壁生长的细胞数量较D组明显减少,但较B组增多,可见少量漂浮细胞。见图4。

  图 5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况a. A组;b. B 组;c. C组;d. D组;e. E组

  2.4.3 ELISA检测与A组比较,B~E组细胞上清液中IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高;与B组比较,C组IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高,D、E组IL-10含量明显升高、TNF-α含量明显降低;

  与D组比较,E组IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高;上述差异均有统计学意义( P0.05)。见图6。

  2.4.4 Western blot检测ERK蛋白相对表达量各组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。与A组比较,B~E组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低;与B组比较,C组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高、Bcl-2蛋白相对表达量明显降低,D、E组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显降低,Bcl-2蛋白相对表达量明显升高;与D组比较,E组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低。以上差异均有统计学意义(P0.05)。见图7。

  图 7 Western blot检测各组细胞中蛋白表达a. 电泳图1:A组2:B 组3:C组4:D组5:E组;b. 各蛋白相对表达量

  2.5.1 ELISA检测与A1组比较,B1~E1组大鼠血清中IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高;与B1组比较,C1组IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高,D1、E1组IL-10含量明显升高、TNF-α含量明显降低;与D1组比较,E1组IL-10含量明显降低、TNF-α含量明显升高;以上差异均有统计学意义(P0.05)。见图8。

  2.5.2 HE染色A1组大鼠椎间CEP细胞数量丰富,胶原清晰可辨,排列整齐,未见炎症浸润或钙化等现象;B1组大鼠椎间CEP细胞数量明显减少,密度随之减小,胶原或断裂或缺失,失去规则形状,炎症细胞大量浸润,多处出现钙化点;C1组大鼠椎间CEP细胞减少更为明显,炎症浸润及钙化点数量较A1组严重;D1组大鼠椎间CEP细胞数量明显回升,炎症浸润明显缓解,偶见钙化点;E1组大鼠椎间CEP细胞损伤较B1组轻,但比D1组严重。见图9。

  2.5.3 TUNEL染色A1~E1组大鼠椎间CEP细胞的凋亡率分别为8.35%±0.79%、33.14%±1.31%、37.48%±0.89%、18.24%±1.36%、23.67%±2.25%。与A1组比较,B1~E1组细胞凋亡率明显升高;与B1组比较,C1组细胞凋亡率明显升高,D1、E1组细胞凋亡率明显降低;与D1组比较,E1组细胞凋亡率明显升高;以上差异均有统计学意义(P0.05)。见图10。

  2.5.4 Western blot检测ERK蛋白相对表达量各组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。与A1组比较,B1~E1组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低;与B1组比较,C1组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低,D1、E1组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显降低,Bcl-2蛋白相对表达量明显升高;与D1组比较,E1组HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低。以上差异均有统计学意义(P0.05)。见图11。

  椎间盘退行性病变过程中发生的椎间盘组织结构性损伤、中枢性椎间盘内营养物质供应失衡、细胞代谢终产物逐渐集聚,以及细胞外基质日益降解等情况,均与处于椎间盘内炎症性微环境中的椎间CEP细胞退变密切相关[16-17]。Gorth等[18]研究指出IL-1β在椎间盘退行性病变中发挥关键作用,并且细胞和动物模型显示IL-1β含量的变化直接影响椎间CEP细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。众所周知,IL-1β是一种细胞进行炎症性应激的早期介质,炎症性应激的进展以及炎症后期介质将如何影响椎间CEP细胞的退变[19],相关报道较少。炎症性应激的晚期介质HMGB1在关节炎、强直性脊柱炎等炎症性疾病的进展中发挥重要作用[20],但在椎间盘退行性病变中作用的报道较少。研究显示[21]在椎间盘退行性病变过程中,椎间CEP细胞因椎间盘内环境pH值的改变以及酸性有害物质的积累等,CEP中促炎因子如TNF-α大量合成、表达、释放,相关抗炎因子如IL-10表达受限,HMGB1表达被激活(HMGB1的激活能促进更为广泛的炎症相关信号转录与翻译[22]),这些炎症信号的正反馈推动了更大范围的HMGB1释放,促进其下游分子ERK磷酸化,将炎症信号传导至细胞核,甚至周围细胞、组织中,将炎症性应激的反应级联放大[23],诱导椎间CEP细胞的异常凋亡。本研究采用IL-1β制备椎间CEP细胞的炎症环境,体外实验结果显示,RES能明显增强炎症环境中椎间CEP细胞的生长活性,降低其凋亡率,降低促炎因子TNF-α的释放,升高抗炎因子IL-10的含量,并且抑制HMGB1的表达,抑制椎间CEP细胞的体外炎症性应激。上述结果提示HMGB1作为CEP退行性病变治疗的靶点具有十分广阔的前景。

  已有研究证实[24-25]抗HMGB1治疗可减轻骨性类风湿关节炎、脊髓缺血再灌注损伤等炎症性疾病中组织的病理损伤,缓解骨相关组织的功能障碍。贺亚军等[26]研究报道在大鼠脊髓损伤模型中,抑制HMGB1信号传导,能明显减少实验动物胶质瘢痕形成,降低炎症因子释放,促进其后肢运动功能恢复。Kawakubo等[27]研究显示在脂多糖诱导的小鼠椎间盘损伤模型中,进行抗HMGB1治疗能明显抑制椎间盘内椎间CEP细胞凋亡,改善小鼠椎间盘组织的功能。本研究中动物实验结果显示,在SD大鼠椎间盘CEP退行性病变模型中,D1组大鼠椎间盘组织损伤明显缓解,椎间CEP细胞凋亡率明显下降,血清中的TNF-α含量降低、IL-10含量升高,组织中HMGB1的表达以及p-ERK水平明显下降,提示了RES对HMGB1信号存在一定抑制作用,提示该信号可能为RES的作用靶点。并以pcDNA3.1-HMGB1在体外与体内进行了功能挽救实验,细胞及动物实验观测指标显示,E组及E1组均明显差于D组及D1组,提示RES+pcDNA3.1能部分逆转RES对HMGB1信号的抑制作用,也印证了RES在疾病中的作用位点。

  综上述,RES能明显抑制炎症诱导的椎间CEP细胞凋亡,这与抑制HMGB1的表达有关。但是如何将这一作用应用到临床治疗中,尚需较大临床样本量和更为系统的研究进一步明确。

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